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Science子刊:消除測序偏好的有效方法
2016/3/16 15:11:34 瀏覽次數:221

Science子刊:消除測序偏好的有效方法

 

        蘇黎世聯邦理工學院(ETH Zurich)的研究人員開發了確保測序質量的有效方法,并在此基礎上獲得了全面且準確的抗體圖譜。這項研究發表在最近的Science Advances雜志上。  


        為了跟蹤免疫系統激活后的抗體生成情況,研究人員對攜帶抗體生產指令的mRNA進行了測序分析。“近年來測序技術取得了很大的進展,測序速度顯著加快,測序成本大幅下降。然而目前的測序方法并不適合分析抗體RNA,”領導這項研究的Sai Reddy教授解釋道。機體產生的抗體種類非常多,測序抗體RNA需要很高的靈敏性和準確性。  


        Reddy及其同事創建了一個使用基因條碼的控制系統,對RNA測序進行補充和完善。這個系統與計算機分析結合起來,大大提升了RNA測序的精確性,消除了人為引入突變和RNA分子相對濃度的干擾。“通過這種方式我們能夠去除超過98%的測序錯誤,”Reddy實驗室的博士后Tarik Khan說。


        研究人員將自己開發的體系命名為分子擴增指紋(MAF)。他們在PCR擴增之前給每個RNA分子隨機打上獨一無二的“條碼”。他們還在擴增過程中添加另一種條碼,以記錄PCR擴增的偏好。計算機分析可以通過這些條碼將原始抗體RNA與測序中發生突變的分子區分開,還能夠確定抗體RNA原本所占的比例。  


        這項研究為人們展示的抗體測序方法,適合多種免疫學研究。Reddy正在與多家制藥公司合作,把這一方法用于抗體藥物和疫苗的開發。“我們的技術可以精確反映HIV感染者體內的免疫應答過程,”Reddy教授指出。“過去人們只能發現免疫應答中豐度較高的抗體,測序可以準確快速的鑒定那些罕見抗體。”蛋白質分析需要抗體達到較高的濃度,無法檢測疾病早期產生的少量抗體分子。這項研究中的測序方法有望幫助人們盡早診斷出癌癥和自身免疫疾病。  


        新一代測序技術在爆炸式發展的同時,也衍生出許多其他技術創新。RNA深度測序(RNA-Seq)就是其中之一,這項技術使我們對細胞發育及其調控機制的理解,達到了前所未有的深度和廣度。那么RNA測序究竟可不可靠呢?


        由美國FDA牽頭的測序質量控制(SEQC)項目對RNA測序的準確性、可重現性和信息含量進行了綜合性評估。其初步調查結果發表在2014年09月的Nature Biotechnology雜志上,石樂明教授是這篇文章的通訊作者之一。研究人員用RNA參照樣本在全球多個實驗室的Illumina HiSeq、Life Technologies SOLiD、Roche 454平臺上進行檢測,主要評估RNA測序在接頭區域和差異性表達譜中的表現,并將其與芯片和定量PCR(qPCR)進行比較。研究表明,數據分析的算法會對RNA測序產生很大影響,不同算法生成的轉錄本數據存在很大差異。


        浙江大學和哈佛大學的研究人員在Cell Reports雜志上發表了一項單細胞mRNA-seq研究。基因表達變異是小鼠胚胎干細胞(ESC)的一個重要特征,但人們一直不清楚這背后的具體原因。研究人員通過分析小鼠胚胎干細胞發現,這些細胞表現出的異質性是血清培養造成的。他們在其中鑒定了高度變異的基因簇,以及獨特的染色質狀態。研究顯示,雙價基因(bivalent gene)更容易出現表達變異。進一步研究表明,無血清培養可以減少小鼠ESC的異質性和轉錄組變異。這意味著,細胞內的網絡變異大多是細胞外的培養環境造成的。


        在生物學中,位置信息是很重要的。mRNA是活躍基因的功能性拷貝,它們在活組織中的定位,往往與細胞和組織的生長發育調控有關。以往人們要磨碎細胞才能同時分析多個mRNA,但這樣就無法了解mRNA在細胞中的定位。哈佛醫學院Wyss研究所的科學家們解決了這個問題。George M Church和Je Hyuk Lee領導團隊開發了熒光原位RNA測序(FISSEQ)技術,該技術可以在固定的細胞和組織中,獲得全基因組范圍的基因表達圖譜。


參考文獻:Accurate and predictive antibody repertoire profiling by molecular amplification fingerprinting. Science Advances

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